NextSeq CN500基因测序仪

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EA-GALO快速建库核心技术

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技术原理

科诺安应用领域广泛。在产前检测领域采取绒毛、羊水或脐血,流产原因排查领域采用流产物的组织样品,染色体疾病检测及自闭症原因排查领域采用患者的外周血进行检测。

无论何种样品,首先提取样品DNA,采用自主研发创新的快速简易建库方法(EZ-GALO)进行文库的制备并在NextSeq CN 500高通量测序仪上进行深度测序,测序所得的Reads通过RUPA快速比对法与人类基因组进行完全匹配比对。

比对时,我们将人类基因组划分为若干个连续的区域,统计每个区域内各个样本完全匹配的Reads个数,根据统计结果计算样本间的log2比值,并采用特定算法判读待测样本的微缺失或微重复区域,进而判断待测样本的染色体情况。

具体流程如下图:

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首先,将测得的序列与已知人类参考基因组比对。然后,通过将每条染色体分为连续的20kb bins计算序列密度。对于特定样品的每个bin i,统计这个bin中唯一并完美匹配的序列数(RNBi),然后利用这个样品测序所得的序列总数和这个bin i中含有的所有可能的唯一36bp序列数(Ui)进行标准化处理,计算公式如下:NRNBi=RNBi/(样品序列总数)×(8×106)/Ui,该公式中的NRNBi指与bin i唯一并完美匹配的标准序列数。对于对照样品的任何bin i,则计算NRNBi的中值(μi)。我们假设对于每个bin,对照样品之间异常拷贝数鲜有变化,因此,NRNBi的中值μi可代表染色体正常拷贝数。对于待测样品的每个bin i,我们计算了待测样品标准序列数和正常拷贝数的比值(ratioi),计算公式如下:ratioi=NRNBi/μi。然后我们标绘了待测样品所有bins的log2(ratioi)值,以计算出每条染色体的拷贝数值。参照已发表研究中的Fused Lasso算法确定染色体片段的重复或缺失。最后,参照已发表研究中的方法分别计算每个待测样品j的每条染色体的归一化染色体代表值(NCRj)和参考样品f的每条染色体的归一化染色体代表值(NCRf),以确定染色体的嵌合比例。染色体的嵌合比例计算公式如下:(NCRj—NCRf)/ NCRf。

参考文献:Wang Y, Chen Y,et al. Maternal mosaicism is a significant contributor to discordant sex chromosomal aneuploidies associated with noninvasive prenatal testing. Clin Chem. 2014 Jan;60(1):251-9.