cSMART血浆游离DNA检测技术

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独创的血浆DNA测序文库构建技术,保证昂科益极高的准确率

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Berrygenomics014

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cSMART技术

什么是循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)

早在1948年,研究人员便在外周血中发现了游离DNA。30年后,研究人员发现肿瘤患者外周血中DNA含量显著高于正常人,随后研究人员在患者外周血中检测到了突变的原癌基因,并且与原发肿瘤一致,证实了循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)的存在。

与正常人相比,肿瘤患者体内存在大量的ctDNA,它们来自于凋亡或/和坏死的肿瘤细胞,这些源于肿瘤组织或循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)的DNA片段携带着肿瘤特异性DNA序列进入血液循环,形成了可在外周血中检测到的循环肿瘤DNA。

临床个体化诊疗遇到的重要瓶颈之一即是大部分肿瘤患者无法进行组织活检,以肺癌为例,临床上初诊的70-80%非小细胞肺癌病人已到晚期,失去了手术机会,肿瘤组织获取困难;另一重要瓶颈来自于普遍存在的肿瘤异质性,同一病灶内的不同细胞间存在差异,原发灶与转移灶之间存在差异,不同转移灶之间也可能存在差异,这些都对以肿瘤组织为检验样本的检测方法提出了挑战,而存在于外周血的循环肿瘤DNA片段无疑成为这些患者的福音。循环肿瘤DNA中的特异性序列与组织样本来源的肿瘤特异性序列保持着高度的一致性,通过对循环肿瘤DNA测序,分析其突变类型与数量,确定对该突变类型敏感的治疗手段和靶向药物,对肿瘤治疗进行预后检测,最终形成针对不同患者的个体化诊疗方案。

cSMART可高灵敏度和高准确性地定量检测循环肿瘤DNA(ctDNA)

肿瘤患者的外周血中除含有ctDNA外,大多数的游离DNA来自于正常细胞,ctDNA只占外周血游离DNA的很小一部分。如何对微量的ctDNA进行准确的检测与定量,是依靠ctDNA进行肿瘤检测必须要解决的难题。

贝瑞和康自主研发的环化单分子扩增和重测序技术(Circulating Single-Molecule Amplification and Resequencing Technology,cSMART),通过对外周血中游离DNA片段进行标记、 环化、扩增和高通量测序,并采用独特计数方式,检测灵敏度达3/10000,因此能够准确、定量地分析外周血中游离DNA片段所携带的多种突变。cSMART技术已成功应用于无创产前单基因病的检测中,相关研究发表于2015年的《 Clinical Chemistry》上。

cSMART

图1.cSMART技术原理

参考文献:Lv, W., et al., Noninvasive Prenatal Testing for Wilson Disease by Use of Circulating Single-Molecule Amplification and Resequencing Technology (cSMART). Clin Chem, 2015. 61(1): p. 172-81.

表1: 常见无创肿瘤DNA检测方法对比

检测方法 技术分辨率 定量结果重复性(CV)* 多突变Panel检测 新发突变检测
PCR平台 ARMS-PCR 1/100 N/A
ddPCR 1/1000 20%
BEAMing 1/1000 20%
NGS平台 捕获测序 1/100 10%
PCR扩增子测序 1/500 20%
cSMART 3/10000 5%

肿瘤组织与胎儿胎盘有着类似的释放DNA片段的现象,因此,cSMART技术在肿瘤检测领域同样具有广阔的应用前景。

基于cSMART技术的无创肿瘤DNA检测可以准确判断血浆中ctDNA的突变位点及数量,指导制定针对不同病患的个体化治疗方案。此外,可在用药前后多次取样,以血浆中含有基因突变的ctDNA比例作为指标,实时监测疾病进展,及时发现耐药性突变,方便临床医生调整治疗方案。该技术的临床验证试验已在北京、浙江、河南等地的多家三甲医院开展,并取得良好的实验数据。

cSMART应用于无创肿瘤DNA检测,对比配对肿瘤组织样本的灵敏度达96.0%*

针对103位III期和IV期非小细胞肺癌患者,采集血液样本,进行昂科益非小细胞肺癌基因检测,并与配对肿瘤组织样本的分子诊断结果进行对比。试验结果显示:

敏感性 >96
特异性 >100
总符合率* >99

*以EGFR L858R基因突变计

cSMART可高灵敏度和高准确性地定量检测组织样本DNA

cSMART技术还可以应用于肿瘤组织样本,并开展临床验证试验。针对184位非小细胞肺癌患者,采集肿瘤组织样本,分别采用昂科益cSMART技术和ARMS-PCR进行检测,试验结果显示: cSMART应用于组织样本对比配对肿瘤组织样本的ARMS-PCR结果,灵敏度达95.8%

敏感性 >95.8
特异性 >93.8
总符合率* >94.6

*以EGFR基因突变计

cSMART的技术优势

  • 高覆盖度:>99%热点区域覆盖
  • 高深度:40000x平均测序深度
  • 高均一度:>90%热点区域的测序深度>20000x
  • 高灵敏度:3/10000检测灵敏度可有效识别低比例突变
  • 高符合度:>90%阳性符合率,>99%阴性符合率,>95%总符合率

cSMART的检测优势

  • 简便全面:仅需10 mL静脉血,即可实时进行多基因、多位点、多种突变类型检测。对于组织样本,也可进行该检测。
  • 准确灵敏:通过独特的barcorde接头和反向引物设计,最大限度降低PCR扩增的偏好性,保证较高灵敏度与准确性
  • 绝对定量:可随时取样进行绝对定量检测,精准及时的获取肿瘤基因突变信息
  • 稳定可靠:历经数千例临床样本的有效验证,流程更稳定,结果更可靠。