[转载]无创伤性产前诊断胎儿染色体非整倍体的研究进展

[转载]无创伤性产前诊断胎儿染色体非整倍体的研究进展
刘福民

刘福民,江苏省 徐州医学院附属医院妇产科,221002
关键词:产前诊断胎儿染色体


染色体非整倍体异常是指细胞中个别染色体的增多或减少形成的染色体数目异常。产前诊断中最常见的胎儿非整倍体异常有21-三体、13-三体、18-三体以及性染色体综合征等。染色体整倍体改变多导致流产,而非整倍体改变可以出生能存活的出生缺陷儿。因此,检测胎儿非整倍体异常是许多孕妇接受产前诊断的主要原因。传统的产前诊断措施是采用侵入性方法获取胎儿物质,如绒毛取样、羊水穿刺和胎儿脐静脉穿刺等,这些操作会给胎儿带来一定的风险。1969年Walknowska等在怀男胎的孕妇血液循环中发现了46,XY的中期分裂相,因此提出母血中可能存在着胎儿细胞。这一观点引起了人们对无创伤性产前诊断的兴趣。研究者希望从母血中富集胎儿细胞获得胎儿染色体信息,由于母体循环中的胎儿细胞数量稀少,细胞的富集过程既复杂且价格昂贵,所以至今尚不能应用于临床。1997年,Lo等在孕妇的血浆和血清中检出了游离的胎儿DNA。2000年Poon等[1]在孕有男胎的孕妇血浆中首次发现Y染色体特异的RNA,这些发现为无创性产前诊断胎儿染色体异常开创了一个新的研究领域。
本文就无创伤性产前诊断胎儿染色体非整倍体的研究及其进展进行简要综述。
一、利用孕妇外周血中胎儿细胞诊断胎儿非整倍体异常
利用孕妇外周血中胎儿细胞产前诊断胎儿非整倍体异常,其主要优势在于分离提取的胎儿细胞所提供的是纯净的胎儿核酸,含有完整的胎儿基因组DNA,因此能够进行完整的胎儿染色体核型分析。这是孕妇外周血中胎儿游离DNA或游离RNA所无法比拟的。已发现的孕妇外周血中胎儿细胞主要有滋养细胞、胎儿有核红细胞(nucleated red blood cell,NRBC)、淋巴细胞和粒细胞等。近年还发现一种类似于干细胞的胎儿细胞存在于孕妇外周血中[2-3]。目前为止研究较多的是NRBC。相对其他细胞来说,NRBC是单核细胞,寿命短且稳定,增殖能力有限,不能滞留到下次妊娠。另外,NRBC有明显形态学特点和特殊的细胞表面标志物,易于识别。因此 NRBC被认为是理想的无创伤性产前诊断的靶细胞而受到较多的关注。
1991年,Price首次应用18号染色体特异性探针对母血中胎儿细胞进行检测,诊断出1例18-三体胎儿。Bischoff等[4]采集40例孕妇外周血,以抗CD71和CD45单抗标记NRBC,用流式细胞仪分离胎儿细胞,以 X、Y、13、18和21号染色体特异性探针进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH),准确测定出2例21-三体的胎儿。另外也有研究者报道通过FISH方法检测出21-三体综合征、13-三体综合征和18-三体综合征等染色体非整倍体病例,并且有较低的假阳性率[5-6]。
为了评价利用孕妇外周血中胎儿细胞进行非侵入性产前诊断或筛查胎儿染色体异常是否可以应用于临床,由美国国立卫生研究院支持,美国儿童健康和发展研究院(nationalinstitute of child health and development,NICHD)发起了一个大规模的临床研究,由Bianchi等[7]共收集了6个中心2 744例样本,采用磁性激活细胞分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)或荧光激活细胞分离技术(fluorescence activated cellsorting,FACS)富集胎儿细胞,并用FISH方法检测获得的单胎男性胎儿间期细胞,结果发现MACS和FACS分离富集胎儿细胞的效率分别为44%和13%,与羊水或绒毛核型分析相比对胎儿染色体非整倍体异常检测的敏感性为60%。表明胎儿细胞可用来诊断胎儿非整倍体,但尚不能满足临床应用的要求。
影响胎儿细胞应用于临床诊断的因素首先是富集效率低,能获得的胎儿细胞数量太少。也有研究发现孕妇外周血中NRBC不只是来自胎儿,也含有母源细胞。Troeger等[8]利用Y染色体特异标志物和RhD基因对富集到的有核红细胞进行分析,发现孕妇外周血中NRBC仅大约50%为胎儿源性。因此,在利用NRBC进行非创伤性产前诊断时,须对分离到的NRBC来源进行鉴定,以保证结果的准确性。

在对分离到的胎儿NRBC进行染色体分析时,FISH是最常用的方法。巴塞尔实验室的研究发现,对鉴定后的NRBC,采用FISH方法时,大多数细胞难以进行荧光标记[9]。这可能是由于母体循环中的胎儿细胞具有凋亡特征,细胞核的密度增高以及这些胎儿细胞从相对低氧的胎儿环境进入到富氧的母体循环,细胞受到影响的原因。而且在FISH结果分析中,研究者必须目测筛选成百上千个分裂间期核,劳动强度高,并带有主观性。这些因素都影响了孕妇外周血中胎儿NRBC在产前诊断中的应用[10]。
尽管如此,围绕着利用胎儿细胞进行无创伤性产前诊断的工作仍然在不断地探索中。策略之一是寻找新的胎儿NRBC特异性标志物。另外,改进或选择新的胎儿NRBC的富集方法[11]和分选技术也是研究的方向。如使用合适的重量克分子渗透压浓度结合二倍密度梯度离心法可大幅度提高胎儿NRBC富集效率[12]。Huang等[13]使用微流体磁化方法分离NRBC,可将分离率提高10~20倍,采用散射光谱技术能够提高鉴别胎儿NRBC的能力[14]。基于FISH扫描的自动化显微操纵技术用于检测早、中期妊娠母血标本也显示出良好的应用前景[15]。类似于干细胞的胎儿细胞被认为可能适宜进行细胞培养[2],如果孕妇外周血中胎儿细胞能够培养成功,可以获得足够的用于核型分析的胎儿细胞,再结合改进的FISH技术,如光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY),可能使得非侵入性产前诊断胎儿非整倍体出现突破性进展。
二、利用孕妇血浆中细胞游离胎儿DNA检测胎儿非整倍体
自1997年Lo等在孕妇血浆和血清中检出游离胎儿DNA以后,关于游离胎儿DNA的临床应用研究受到许多关注。有研究发现怀有染色体非整倍体胎儿的孕妇,其血浆或血清中胎儿游离DNA浓度高于怀有正常胎儿的孕妇[16-17],但是在部分正常和非正常妊娠之间胎儿游离DNA浓度存在重叠。另外,在孕11~17周,胎儿DNA平均含量仅占孕妇血浆中细胞游离总DNA含量的大约3%。母源性游离DNA占绝对优势,这就意味着使用传统的DNA提取技术和荧光定量PCR方法难以对胎儿染色体非整倍体异常进行准确诊断。
解决这一问题的途径之一是可以通过改进提取方法,增加提取的胎儿DNA的浓度或抑制母体DNA浓度,减少背景DNA。有研究表明,母血循环中胎儿DNA分子一般比母体DNA分子要短,绝大部分小于313 bp[18-19]。Deng等[20]报道,扩增片段长度在180 bp以下的Y特异的短串联重复序列,可以提高胎儿等位基因的检出率。Jorgez等[21]利用凝胶电泳方法选择性回收母血中不同大小片段DNA,结合全基因组扫描分析,发现回收100~300 bp范围的片段,可以获得更多的细胞游离胎儿DNA。Dhallan等[22]认为在抗凝的外周血中加入少量10%甲醛可减少母体血液中白细胞裂解,从而增加游离胎儿DNA在母体DNA中比例。但是一些研究结果不支持这一观点[23-24]。
克服上述不足的另一个途径是寻找孕妇外周血中新的胎儿特异性标志物,使之能够像检测Y特异序列或RhD血型一样,不受高浓度母体背景DNA的影响。近年来表观遗传学的研究为这一设想提供了可能。表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变。DNA甲基化是最早发现也是最重要的基因表观修饰方式之一。DNA甲基化是在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸 5′端的胞嘧啶转变为 5′甲基胞嘧啶。这种 DNA修饰方式并没有改变基因序列,但是它调控了基因的表达。一般情况下,DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。
2002年Poon等[25]利用甲基化特异性 PCR方法,不仅从母血浆中检测到胎儿从父系继承下来的甲基化等位基因,还检测到从母系继承来的胎儿非甲基化等位基因,说明胎儿与母体之间的基因位点上存在不同的甲基化形式。这一结果为无创伤性诊断胎儿非整倍体提供了依据。Chim等[26]研究显示,编码maspin 基因的SERPINB5基因,在胎盘细胞中处于低甲基化,而在母血细胞中处于高甲基化。因为胎盘是血浆中游离胎儿DNA的主要来源,而母血细胞是血浆中母体DNA的主要来源,推测利用胎儿和母血细胞之间存在的DNA甲基化状态的差异,可以进行胎儿非整倍体的检测。而maspin 基因位于18号染色体,因此可以通过检测maspin 基因的甲基化情况,诊断胎儿18-三体。在此研究思路下,Tong等[27]应用表观遗传学等位基因比率(epigenetic allelic ration,EAR)分析方法,利用maspin 基因启动子区域内的一个杂合性SNP位点(A/C),进行等位基因定量分析。发现妊娠有该杂合SNP 位点正常二倍体胎儿的孕妇,外周血中两种低甲基化的maspin等位基因的比率为1∶1,而妊娠18-三体综合征胎儿的孕妇,外周血中两种低甲基化的maspin等位基因的比率为1∶2或2∶1,从而证明联合利用此差异性甲基化位点和位于此位点的SNP位点,可以进行胎儿18-三体的无创性产前诊断。但是,这种方法也有明显的不足,一个限制就是母亲必须是C/C纯合子,胎盘的基因型必须是A/C杂合子,但这种变异很少见,或许还存在种族差异,比如在129例高加索人的胎盘中未发现C等位基因。另外也有一个技术问题就是甲基化特异性 PCR过程中使用的重亚硫酸盐转换步骤,能够导致本来就很少的胎儿DNA模板被大量破坏,这将严重妨碍试验的效果。因此,有必要探索更恰当的试验方法或策略[28]。
唐氏综合征由于其发病率高而备受关注,为了寻找21号染色体的表观遗传标记,Hultén等[29]采取了3种策略进行筛选,结果在21q22.3发现了3个差异甲基化序列。其中AIRE基因启动子区域的CpG位点高度差异甲基化,可作为无创性产前诊断唐氏综合征重要的候选表观遗传标记。Chim等[30]采用甲基化敏感的单核甘酸引物延伸和(或)重亚硫酸盐测序的方法,系统性搜寻21号染色体上的甲基化位点,在114个CpG岛中,有22个显示出母体和胎儿间的表观遗传学差异。随着这些表观遗传标记研究的不断深入,有可能使无创伤性产前诊断胎儿染色体非整倍体成为现实。
 三、利用孕妇血浆中细胞游离胎儿mRNA检测胎儿非整倍体
2000年 Poon等[1]在孕有男胎的孕妇血浆中首次检测到 Y染色体特异性锌脂蛋白(ZFY)mRNA。此后许多研究证实了孕妇外周血中存在着游离胎儿RNA[31-33]。这些游离胎儿RNA主要来自胎盘,在孕妇血浆中含量丰富,具有极好的稳定性,并且与血浆中胎儿DNA一样,于产后迅速从血浆中清除。这些特性显示了利用孕妇外周血中游离RNA检测胎儿异常是可行的。Lo等[34]报道了测定胎盘特异性因子4(placental-specific 4,PLAC4)基因表达产物诊断胎儿非整倍体的研究结果。PLAC4基因来自胎盘,仅在胎盘表达,具有胎儿特异性。该基因定位于21号染色体,因此,Lo等推测定量分析孕妇血浆中PLAC4 mRNA可以用于诊断胎儿21-三体综合征。由于普通的荧光定量难以满足检测要求,Lo等利用碱基延伸反应和基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)检测PLAC4 mRNA。他们选择了PLAC4基因内的SNP杂合位点进行等位基因比率定量分析。在正常二倍体,PLAC4 mRNA转录的每一个等位基因量是相等的,其比率应为1∶1;而在非整倍体,如21-三体,其比率将是2∶1或1∶2。Lo等[34]检测了10例21-三体的胎儿,结果显示诊断的敏感性为90%,特异性为96%。在57例对照中正确判断了55例正常二倍体,该研究虽然例数不多,但是很有意义,表明了一种无创伤性诊断胎儿非整倍体的新的策略方法。该方法的不足之处在于受检胎儿的SNP位点必须是杂合子,这种基因型只出现于大约50%的被检者[34],因此必须发现更多的SNP位点,或者增加21号染色体特异的细胞游离胎儿RNA的种类。胎儿基因表达谱的研究将有助于这项工作的进一步开展[35-36]。Tsui等[37]用同样的RNA-SNP等位基因比率分析方法检测母血浆中胎盘特异的SERPINB2基因转录的 mRNA,检测出18三体异常。
由于MALDI-TOF MS检测方法的局限性,Lo等[38]将数字PCR用于RNA-SNP的检测,该方法可以准确计数出微量的模板拷贝数变化,这项技术优于质谱之处在于胎儿不必是SNP位点的杂合子,对纯合子胎儿也可以检测,不仅简化了操作,而且扩大了应用范围,提高了检测的有效性和准确性。Go等[39]将淬灭延伸反应和部分变性高效液相色谱应用于RNA SNP方法 成功检测出21-三体胎儿,使得RNA SNP方法不必依赖于昂贵的MALDI-TOF MS设备。
选择细胞游离胎儿RNA进行无创伤性产前诊断的主要优势在于基因转录的mRNA的多拷贝性。另一个优势是胎盘表达的特异的mRNA种类是母体任何组织都不表达的,易于检测,与前述的利用表观遗传学差异选择胎儿特异的标记物一样,分析胎盘来源的RNA类似利用胎儿DNA检测Y特异序列或RhD血型,母体血浆中完全缺乏这种物质,因此检测不受强大的母体DNA背景的干扰。
 四、结语
每年有成百万孕妇需要接受胎儿染色体异常的产前筛查,高风险的孕妇要面对侵入性诊断所带来的压力,而无创伤性产前诊断为她们提供了一种理想的、对胎儿无风险的诊断途径。虽然利用孕妇血浆中胎儿DNA检测Y染色体特异序列以及RhD血型已经常规应用于临床。但是对胎儿非整倍体异常的无创伤性产前诊断仍然存在着检测效率低、实验过程复杂、研究的样本量小等不足,因此目前尚不能满足临床应用的要求。然而,随着孕妇外周血中胎儿物质富集技术的提高、新的检测方法的应用、多中心研究的开展以及诊断策略的完善,这项技术将最终能够成为具有临床价值的检测方法。
新闻来源:中华临床医师杂志(电子版) 2010年5月,4卷5期