[科学文献]无创性产前诊断进展2003 (一)

深入认识遗传病的分子基础,检测特异的基因突变,为发展以DNA为基础的产前诊断提供了基础。遗传分析胎儿DNA已成为常规进行的检测手段,样本是取自最早为妊娠10周的绒毛或妊娠15周的羊水。但这两种侵入性方法都有流产的风险。为了避免这种并发症,已经进行很多努力以发展无创性检测,这些包括从母亲血液循环中探查、描绘、分离胎儿细胞或胎儿游离DNA。最近,在这方面出现了新的进展,新的策略有望为无创性早期产前诊断带来希望。

已经了解几种遗传性疾病的分子机制,大疱性表皮松解症(EB)是取得巨大成功的其中一个例证[1]。EB是一组皮肤水疱性遗传病,现在已经知道在皮肤基底膜区表达的十个不同的基因发生突变是不同EB类型的分子基础。出现多种表现型的原因是皮肤及真皮外组织突变基因的表达水平、突变类型及各种突变的组合以及这些突变对mRNA及蛋白质水平的影响等存在差异[2]。EB中最严重的类型会导致婴儿出生后几个月内死亡或出现明显虚弱、致残性结瘢并导致儿童早期侵袭性鳞状细胞癌。

对这些类型的EB家庭进行产前诊断非常有必要。最初开展的是对子宫内的胎儿皮肤进行诊断性活检,但现在大多被以DNA检测为基础的绒毛膜绒毛活检或羊水穿刺诊断所替代[3]。为了避免这两种技术的并发症,已经作了许多尝试发展新的创伤性更少的技术以探测胎儿基因组,方法有:(1)从母亲循环血液中分离和描绘胎儿细胞DNA。(2)分析母亲血浆中游离的胎儿DNA。这两种方法都只需要简单的静脉穿刺,将其改进将能使现在妊娠10周才能绒毛取样进行诊断的时间提前几周。

从母亲循环血液中识别胎儿细胞

20世纪50年代末首次在母亲循环系统中发现来源于胎盘的滋养细胞,证实母亲循环血液中存在胎儿细胞。随后几年,在妊娠男性胎儿的母亲血液中发现Y染色体片段[4]。之后,多种技术应用于检测循环血液中的胎儿细胞,但出于方便的原因,使用荧光原位杂交(FISH)或PCR分析Y染色体的出现成为循环中男性胎儿细胞的主要标志。另外,通过抗体来鉴别一些在胎儿细胞中特异或选择性表达的蛋白也能识别和分离胎儿细胞。

从母亲循环血液中检测到胎儿细胞的数量取决于孕期及分析方法。任何情况下出现于母亲循环系统的胎儿细胞都罕见,估计正常情况下每104到109个母亲细胞中能检测到一个胎儿细胞[5]。但最近通过对出现Y染色体片段的细胞的准确计数,估计妊娠中期每毫升母亲血液中存在2到6个胎儿细胞[5]。因此大量的母亲细胞构成了对胎儿DNA分析的不良背景。密度梯度离心法(逐步或单纯高密度梯度)能利用幼红细胞、红细胞及其它血细胞浮力密度差异来富集母亲血液中胎儿细胞(表1)。该方法能达到1000倍富集胎儿细胞,但仍存在明显的母亲细胞的污染[6]。而且血样准备过程可能改变胎儿细胞的相对密度,使得难以对密度梯度离心法进行标化[7]。

表1母亲循环血液中的胎儿细胞

细胞类型有助于识别和分离的特性

有核红细胞浮力密度;表达胚胎血红蛋白(z-和e-)、胎儿血红蛋白(g-);转铁蛋白受体(CD71+)。

细胞滋养层表达细胞角蛋白(8/18/19);细胞较大;产生特异的单克隆抗体。

间质干细胞肌纤维母细胞的形态及生长模式;非造血免疫表型(CD142, CD452);间质表达标志(Src同源区2, 3,4 );波形蛋白;纤维结合素和血管细胞粘着分子;培养物的胶原合成原始造血细胞CD34+;增生能力

进一步富集胎儿细胞的方法着重于荧光激活细胞分选法(FACS)[8],这种方法的机理是利用特异抗体选择性识别细胞表面或细胞内标志。其后的磁激活细胞分离法(MACS)通过磁性表面上的铁-抗体复合物捕获标记细胞[9]。选择性抗体是FACS和MACS富集细胞的关键,因而出现了多种选择性抗体,如能从母亲循环中识别细胞滋养层的细胞滋养层特异单克隆抗体[10]。

一项得到快速应用的技术是端粒缺失测定,它是根据胎儿细胞与母亲细胞端粒长度的差异从母亲细胞中区分胎儿细胞的新方法。该法使用Bal31酶控制性地原位消化细胞染色体端粒。在酶消化反应进程的特定时间点,母亲细胞由于端粒较短,在Bal31消化后丢失了端粒,而来源于胎儿的细胞仍能在使用端粒特异探针显色时发出信号[11]。

从母亲循环里识别到的胎儿细胞特性

也许有核红细胞是母亲循环中胎儿细胞特性被了解最清楚的一个,它从胎儿循环系统行进到母血循环。常使用抗CD71抗体识别幼红细胞[12]。但抗CD71的抗体识别转铁蛋白受体,所以也会识别其他有核红细胞及成人细胞,因此得到的是胎儿细胞和非胎儿细胞的混合物。而且,母亲循环中的幼红细胞只有一半来源于胎儿[13]。

与上述方法相似的是使用抗体识别胎儿g-珠蛋白,其水平在妊娠妇女血中升高,结果也存在母亲有核血细胞的污染。此外,虽然识别胚胎珠蛋白链(z或e)的抗体是特异地针对胎儿细胞,但这些珠蛋白分子的表达随怀孕进程减少。尤其是编码z珠蛋白的基因表达在妊期7到8周后显著减少,e珠蛋白的表达消失虽迟些,但只在妊期11到12周存在于低于半数的胎儿有核红细胞,在15周后基本检测不到[14]。

另一类被广泛注意的是滋养细胞,它对于胎盘的发育和功能有重要作用[15]。合体滋养层细胞是出现于胎盘绒毛的多核细胞,与母亲组织直接接触,有时会在母亲循环中出现,但被肺的毛细血管捕获,难以在血液中检测。滋养细胞是单核细胞,能侵入子宫壁及其螺旋动脉,最终出现于母亲循环。可分辨滋养层细胞的其中一个特性是表达角蛋白,而所有的造血细胞及血管内皮细胞均为细胞不表达角蛋白。这种表达特性及滋养细胞特异的单克隆抗体[10,16]的出现为从母亲中富集和分离滋养细胞群提供了条件。但是,使用细胞角蛋白或其他细胞内抗原技术(FACS或MACS技术)分离细胞的缺点是要求细胞膜所具有的通透性能使抗体分子通过从而进入细胞。

从妊娠7周起能在胎儿血液、肝脏、骨髓中检测到间质干细胞(MSC)[17]。特异性标志物的表达能够证明该干细胞的间质表型,例如Src同源域2, 3,4、波形蛋白、纤维结合素和血管细胞粘着分子等[18]。MSC具有多向分化潜能,在适当培养条件下能分化成骨细胞、脂肪细胞、神经元、肌细胞及软骨细胞,在10%胎牛血清培养下呈成纤维细胞外观及生长模式。虽然MSC在母亲循环中的出现及数量尚未明了[19],但是在培养物中易于繁殖提示其有可能成为无创性产前诊断的靶细胞。

最近发现母亲循环中存在表达CD34表面抗原的胎儿定向造血干细胞[20]。该细胞在适当培养条件下数量增加,为进一步分析胎儿基因组提供材料[21]。其主要缺点是存在少量以前怀孕的残留细胞(每20毫升血液1到2个),这被从后来怀有女性胎儿的母亲循环中出现含Y染色体片段的细胞所证实[22]。因而这种细胞在产前诊断中的应用受到性别等因素的限制。