3-2 全长转录组测序Iso-Seq-标题图

全长转录组测序(Iso-Seq)是基于PacBio单分子实时测序技术,凭借超长读长的优势,无需打断RNA分子,直接对反转录的全长cDNA测序,即可得到从5’末端到3’PolyA尾的高质量全长转录本序列,从而对同源异构体(isoform)、可变剪接、融合基因、同源基因、超家族基因、等位基因表达等进行精确分析。

小标题-产品优势-中
超长读长直接测序即可获得完整的全长转录组序列信息;
有效绘制复杂基因组的转录图谱,作为基因功能研究的参考序列;
能准确鉴定同源异构体、可变剪切和融合基因等。

小标题-技术路线-中

3-2 全长转录组测序Iso-Seq-信息分析-有参-附图-小

PacBio有参全长转录组信息分析流程

3-2 全长转录组测序Iso-Seq-信息分析-无参-附图-小

PacBio无参全长转录组信息分析流程

小标题-样品要求-中

图标-NGS紫-样品-小

Total RNA

总量≥2μg,浓度≥300 ng/μl;

RIN值≥8.5;

无DNA及蛋白质污染,无降解

图标-NGS紫-文库-小

文库

1~4Kb,4~10Kb

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策略

测序平台:PacBio Sequel

测序深度:4~8 Gb/样本

小标题-案例分析-中

PacBio Iso-seq揭示玉米转录组的复杂性

冷泉港实验室的研究人员选取6种不同的玉米组织进行全长转录组测序,在进行信息分析过程中,与参考基因组B73 RefGen_v3比对注释,进行了新的isoform鉴定,发现了大量新基因和新的转录异构体;进一步对不同组织进行差异分析,鉴定出组织特异性的可变剪接分析、IncRNA分析与鉴定、isoform鉴定分析。

在具体的研究过程中,作者选取玉米(Inbred line B73)不同发育阶段的6个组织,包括根、花粉、胚、胚乳、幼穗和幼雄穗。采用Pacbio RS Ⅱ平台的Iso-Seq策略,共发现了111151个isoform,对应于27000个基因,几乎是参考基因组中转录本数目的一倍。进一步研究发现3%的isoform代表了新位点的新转录本,而57%是新的isoform,与带注释的参考基因至少有一个共同的剪接位点。之后研究人员采用Illumina HiSeq 2000平台PE101测序重复样本的RNA,以便验证和量化PacBio产生的转录本isoform。对比PacBio数据,6种组织中平均86%的剪接点获得短读长测序的支持。此外,不同玉米组织内的可变剪接类型、lncRNA种类和数量存在显著的差异,而高水平的CHG甲基化可能会抑制可变剪接发生,长片段的转录组数据也有助于修复不正确的基因模型。

3-2 全长转录组测序Iso-Seq-案例分析-附图-小

Pacbio测序结果与RefGen_v3注释结果对比

Bo Wang, Elizabeth Tseng, Doreen Ware., Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing. Nature Communications.2016,7:11708