随着基因组研究的不断推进,以PacBio测序为代表的第三代基因测序技术逐渐应用到多个科研领域。该平台利于单分子实时测序技术,又称作SMRT(Single Molecule Real-Time)测序,基于纳米小孔的单分子读取技术,无需扩增即可快速完成序列读取。PacBio Sequel测序仪是美国太平洋生物技术公司(Pacific Biosciences)基于PcaBio RSII平台的基础上,最新推出的第三代测序平台,该系统以测序通量高、单Gb数据成本低、周期短而突出于RSII平台。

测序原理

PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想,主要以四色荧光标记的dNTP在ZMW孔完成了对单个DNA分子的测序。在测序过程中,以SMRT芯片为测序载体,DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记 4 种碱基,在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

ZMW孔:即零模波导孔(Zero-Mode Waveguides),合成反应在ZMW中进行,每个SMRT Cell上约有100万个ZMW,在测序过程中,大约有1/3处于活跃状态。

平台优势

超长的测序读长

平均读长8-10Kb,最长可达最长可达40-70Kb,轻松覆盖高重复、高复杂区域

超高的测序通量

一个Cell的密度由原来的15万个ZMW孔增加到100万个,极大的提高了测序通量

最小的GC偏向性

在极端高GC和极端低GC区域,可以轻松测定,从而保证序列的均匀覆盖度;

无PCR扩增偏向性

建库过程中,DNA不需要进行PCR扩增,避免了覆盖度不均一和PCR冗余;

直接检测广泛的碱基修饰

除了5-methylcytosine修饰以外, 还可以检测N6-methyladenine, N4-methylcytosine, DNA氧化损伤以及其它碱基的修饰。