技术简介

DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要的作用。Bisulfite处理能够将基因组中未甲基化的胞嘧啶与甲基化的胞嘧啶区分开来,因此成为表观遗传学研究的经典实验方法。Bisulfite处理与高通量测序技术相结合的测序方法—Bisulfite Sequencing能够绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。特定物种的高精确度甲基化修饰模式的分析,为广泛应用于细胞分化、组织发育等基础机制研究,以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。

技术路线

全基因组甲基化测序 - New Page

全基因组甲基化测序,其采用亚硫酸氢盐处理基因组DNA使未甲基化修饰的胞嘧啶C碱基转化为尿嘧啶U,通过对处理后的DNA进行全基因组重测序,从而对整个染色体、基因的不同功能区域以及基因组中的重复元件的甲基化进行分析,从基因组水平实现单碱基的甲基化水平分析。

生物信息分析

methy - 甲基化

信息分析   

标准分析内容:

1)Bisulfite-seq数据产出统计:

数据产出总量;C的测序深度统计;基因组覆盖度统计,全基因组甲基化率统计;

2)测序数据与目的物种基因组进行比对(甲方提供基因组序列或数据可下载链接地址);

3)鉴定C碱基的甲基化状态及在基因组上的分布,按每条染色体呈现统计结果:

a)统计各染色体所有5mC的数量,位置及甲基化水平;

b)统计所有5mC中CpG,CHG,CHH所占的比例;

c)统计不同基因功能区域(全基因组范围,全基因组的Repeat区域)内5mC中CpG,CHG,CHH所占的比例及甲基化水平)。

高级分析内容:

1)多样品间的差异性甲基化区域(DMR)分析(比对个数不能超过测序个数);

2)DMR处的基因功能注释。

案例分析

Heyn H, Vidal E, et al., Whole-genome bisulfite DNA sequencing of a DNMT3B mutant patient. Epigenetics. 2012;7(6):542-50.

ICF综合征与DNA甲基化转移酶DNMT3B突变相关,该突变可导致甲基化转移酶活性降低。免疫系统基因表达异常、基因组中结构变异区的去甲基化和染色体的不稳定性是导致ICF表型的主要原因。

样品选择:健康捐献者正常B细胞和ICF患者淋巴细胞

测序策略:全基因组甲基化测序

结果:

1.从基因组水平上,检测到甲基化水平下降,这些区域主要集中在不活跃的异染色质的区、微卫星重组区和转座子区;

2.ICF患者的平均甲基化水平显著降低;

3.ICF患者中DNMT3L和DNMT3B突变相互作用引起DNMT3B活化作用降低;

4.低甲基化数量ICF患者是健康人的3倍;

5.在所有染色体中,鉴定了315813个差异甲基化区域,在ICF患者中,几乎全是低甲基化。

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图为:全基因组DNA甲基化水平

样品要求

1.DNA 样 品 总 量:全基因组甲基化测序需要提供6μg的基因组DNA;为保证实验质量及延续性,请一次性提供至少2次样本制备量;

2.样品浓度和纯度: 基因组样品浓度>50ng/μl; OD260/280介于1.8-2.0,无肉眼可见污染;

3.样品保存:请选择乙醇、纯水进行保存,并在样品信息单中注明;

4.样品运输:请将样品置于1.5ml管中,并用封口膜封好。