技术简介

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要的作用。针对全基因组甲基化测序成本相对昂贵,即产生了简化甲基化测序,该方法通过酶切富集启动子及CpG岛区域,硫化处理及片段富集,构建文库后进行测序,同时实现DNA甲基化状态检测的高分辨率和测序数据的高利用率。

技术路线

简化甲基化测序 - New Page

利用限制性内切酶对基因组进行酶切,可以极大幅度的提高CpG区域的测序深度,与全基因组甲基化测序相比减少大量的测序量,在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以达到高精度分辨率。同时,利用RRBS可以实现多个样本的比对基因组分析。

信息分析

1、 数据产出统计及基本的数据质控处理

2、 测序数据与目的物种基因组进行比对

3、胞嘧啶C的测序深度统计

4、 Promoter和CpG岛上覆盖度及甲基化分析

5、 鉴定胞嘧啶C碱基的甲基化状态及在基因组上的分布

案例分析

Ziller MJ, Müller F, Genomic distribution and inter-sample variation of non-CpG methylation across human cell types. PLoS Genet. 2011;7(12):e1002389.

众所周知,DNA甲基化在生物发育和疾病中起到至关重要的作用。先前的研究主要集中于CpG的甲基化,如它在人和小鼠中占到总基因组甲基化的3/4,它的分布、功能和个体间的稳定性我们已经相当了解。但是,对于非CpG甲基化,即CpA、CpT和CpC二核苷酸甲基化知之甚少。

样本选择:20个胚胎干细胞,12个iPS细胞,10个不同的体细胞类型

测序策略:简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) )

分析结果:

1、non-CpG甲基化主要出现在多能干细胞中,已经分化的细胞有所降低,特化的体细胞中几乎完全没有发现。

2、没有发现non-CpG甲基化具有什么特定的功能,但是它在诱导iPS cell形成过程中得到重现。

3、non-CpG甲基化程度和DNA甲基化转移酶(DNMT3)的表达量具有强相关性,为了证明这种关系,在hESCs中,敲除DNMT3A和DNMT3B后,non-CpG甲基化程度整体下降。

4、作者还发现,non-CpG甲基化与CpG甲基化相关。

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图为:人类胚胎干细胞,DNMT3A敲除后导致非CpG甲基化的变化

样品要求

1、DNA样品总量:简化甲基化测序需要提供2μg的基因组DNA;为保证实验质量及延续性,请一次性提供至少2次样本制备量; 2、样品浓度和纯度:基因组DNA样品浓度>50ng/μl; OD260/280介于1.8-2.0,无肉眼可见污染; 3、样品保存:请选择乙醇、纯水进行保存,并在样品信息单中注明; 4、 样品运输:请将样品置于1.5ml管中,并用封口膜封好。