技术简介

宏基因组测序,是对特定环境样品中的微生物群落基因组进行高通量测序,以分析微生物群体基因组成及功能,解读微生物群体的多样性与丰度,探求微生物与环境、微生物与宿主之间的关系,发掘和研究新的、具有特定功能的基因。宏基因组测序研究避开了微生物分离培养的过程,扩展了微生物资源的利用空间,为微生物的研究提供了有效工具。

技术路线

宏基因组测序 - New Page

提取环境微生物总DNA,采用HiSeq或者MiSeq测序仪进行高通量测序,然后进行生物信息分析,鉴定低丰度的微生物群落,挖掘更多基因资源,对微生物群体的物种分类研究、群落结构、系统进化、基因功能分析以及物种间的代谢网络等分析。

信息分析

1、标准信息分析内容

1)原始数据量统计及测序质量评估;

2)Reads水平:将reads与参考序列(已发布细菌基因组或由甲方提供的序列)进行比对,获取物种分类信息以及与每个物种的reads比对情况统计;

3)Contigs水平:经组装得到contigs序列,拼接结果统计及拼接长度统计。(若样品复杂度很高,contig拼接效果不理想,则将短片段文库的Paired-End reads两端的重叠区连接起来,进行后期分析。根据客户需求确定);

4)基因预测:采用 Metagene 基因预测软件对组装后序列进行基因预测(如选择分析3,则进行该项分析);

5)基因功能注释:利用 blast 对比对的reads进行NT,NR, COG, Swissprot注释或interproscan进行注释。

2、高级信息分析内容

1)样品中的物种组成分布;

2)样品间比较 :找出差异基因、COG、COG 类群(样品对比关系由甲方提供);

3)KEGG 分析:将差异变化的基因在 KEGG 数据库中分析,找出这些基因富集的通路。

案例分析

Andreote FD, Jiménez DJ, et al., The microbiome of Brazilian mangrove sediments as revealed by metagenomics. PLoS One. 2012;7(6):e38600.

样本选择:3种不同的红树林(分成4个样本)

测序策略:宏基因组测序

分析结果:

1、获得了215Mb的数据,分类表明在这些样品中以Gamma和Delta变形菌占主导地位;

2、代谢重组分析表明,在红树土壤沉积物中发现了对氨素调控存在优势条件的变形菌;

3、本文还对氮循环以及产生H2S和亚硫酸盐的相关序列进行了分析。

16

样品要求

1、样品总量:宏基因组测序一次文库制备所需要的样品量为3μgDNA或50ng cDNA片段样品(片段长度200-500bp) 为保证实验质量及延续性,请一次性提供至少两次的制备量。

注:不同环境DNA质量差别较大,具体样品量请咨询当地技术人员。

2、样品浓度和纯度:环境样品浓度>20ng/μl;宏基因组为5ng/μl;OD值260/280应在1.8-2.0之间,无蛋白质、RNA或肉眼可见杂质污染。

3、样品保存:请选择干粉、酒精、TE buffer或超纯水一种,并在样品信息单中注明。

4、样品运输:请将样品置于1.5ml管中,并用封口膜好。