技术简介

真核生物的基因组在细胞核中以染色质的形式存在,染色质是由DNA和蛋白质组成的复合物,研究DNA和蛋白质在染色质形式下的相互作用对于阐明真核生物的基因表达机制具有重要意义。

染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是研究蛋白质与DNA相互作用的经典实验方法,广泛的应用于组蛋白特异性修饰位点、转录因子结合位点等的研究。

随着新一代测序技术的成熟与发展,整合了染色质免疫共沉淀与高通量测序技术的ChIP-Seq,是继ChIP-Chip之后,蛋白质与DNA相互作用研究的又一技术突破。

技术路线

ChIP-SEQ测序 - New Page

ChIP-Seq采用特异抗体对目的蛋白进行免疫沉淀,分离与目的蛋白结合的基因组DNA片段,对其进行纯化和文库构建,再通过高通量测序的方法,在全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA片段信息。

信息分析  

1、原始数据产出统计;

2、与基因组比对(需甲方提供参考基因组信息,如hg19);

3、比上的Reads在基因组各区域的分布;

4、Reads相对TSS(transcript start site)、TTS(transcript terminal site)的depth分布;

5、全基因组Peak Calling;

6、基因组上检测到的Peak统计分布(峰数目,峰间距,峰宽度等);

7、每个样本的检测到的Peak在基因组各区域的分布情况;

8、提供与样本Peaks相关的基因列表;

9、Peaks相关基因Gene Ontology功能分类;

10、Case 相对control的差异 peaks及其相关基因差异统计;

案例分析

Cong R, Das S, Interaction of nucleolin with ribosomal RNA genes and its role in RNA polymerase I transcription. Nucleic Acids Res. (2012);40(19):9441-54.

核仁素是rRNA体内转录所需的具有多种功能的核蛋白,但是核仁素调控RNA聚合酶转录的机制尚不清楚。

样本选择:人子宫颈癌传代细胞(6×105

测序策略:ChIP-SEQ

分析结果:

1、核仁素缺乏的细胞中, rRNA前体的低累积量不是rRNA加工抑制影响核糖体生物合成和转录的结果,可能是核仁素转录过程中自身作用的结果。

2、核仁素的缺乏会导致染色质标记H3K9me2增高,而常染色质组蛋白标记H4K12Ac和H3K4me3降低。

3、ChIP-seq实验证实核仁素在rDNA的编码区和启动子区明显富集。核仁素能够影响转录终止因子1在启动子-近端终止子T0的结合,因此抑制了TIP5和HDAC1的结合,并导致异染色质状态的形成。

4、核仁素对常染色质状态的保持和rDNA转录延伸起到重要的调控作用。

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图为:在rRNA转录中核仁素作用的描述

样品要求

1、需提供至少2ng 样品起始量的ChIP-seq建库产品,要求ChIP片段长度200-500bp,为保证实验质量及延续性,请一次提供至少2次样本制备的量;

2、样品浓度和纯度:基因组DNA样品浓度>0.5ng/μl; OD260/280介于1.8-2.0,无肉眼可见污染;

3、样品保存:请选择乙醇、纯水进行保存,并在样品信息单中注明;

4、样品运输:请将样品置于1.5ml管中,并用封口膜封好。